極性改性反相色譜柱是指利用非極性的反相介質(zhì)為固定相,極性有機(jī)溶劑的水溶液為流動(dòng)相,根據(jù)溶質(zhì)極性的差別進(jìn)行溶質(zhì)分離與純化的洗脫色譜法。與HIC一樣,RPC中溶質(zhì)也通過(guò)疏水性相互作用分配于固定相表面,但是,RPC固定相表面被非極性基團(tuán)所覆蓋,表現(xiàn)出強(qiáng)烈的疏水性。因此,需用極性有機(jī)溶劑或其水溶液進(jìn)行溶質(zhì)的洗脫分離。
溶質(zhì)在反相介質(zhì)上的分配系數(shù)取決于溶質(zhì)的疏水性,一般疏水性越大,分配系數(shù)越大。當(dāng)固定相一定時(shí),可以通過(guò)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的組成調(diào)整溶質(zhì)的分配系數(shù)。RPC主要應(yīng)用于相對(duì)分子質(zhì)量低于5000,特別是1000以下的非極性小分子物質(zhì)的分析和純化,也可以用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分析和純化。由于反相介質(zhì)表面為強(qiáng)烈疏水性,并且流動(dòng)相為低極性的有機(jī)溶劑,生物活性大分子在RPC分離過(guò)程中容易變性失活,所以,以回收生物活性蛋白質(zhì)為目的時(shí),應(yīng)注意選用適宜的反相介質(zhì)。
反相介質(zhì)的商品種類(lèi)繁多,其中代表性的是以硅膠為載體,通過(guò)表面鍵合非極性分子層制備。通過(guò)控制反應(yīng)時(shí)間和溫度,可獲得性能穩(wěn)定的反相介質(zhì)。在硅膠基質(zhì)的反相填料中,以鍵合有C18、C8、C2的球形多孔填料較為常見(jiàn),用途較廣。
RPC固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團(tuán),基于樣品中的不同組分和疏水基團(tuán)之間疏水作用的不同而分離。在生物大分子分離中,多采用離子強(qiáng)度較低的酸性水溶液,添加一定量乙腈、異丙醇或甲醇等與水互溶的有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。
極性改性反相色譜柱的日常使用注意事項(xiàng):
1、如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相,應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈,并保存于甲醇或乙腈中。
2、氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性,故使用時(shí)要注意,柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類(lèi)溶劑,以避免腐蝕。
3、若流動(dòng)相是緩沖鹽并且鹽的濃度比較高分析完畢樣品不要停泵,要立即沖洗色譜柱或者低流速平衡,以免色譜柱前段柱篩板堵塞。
4、使用預(yù)柱保護(hù)分析柱(硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度)。
5、避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化。
6、流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過(guò)濾處理。